Rakstā ir ierosināta jauna mikrofluidisko mikroshēmu tehnoloģija garneļu patogēno mikroorganismu multipleksa noteikšanai. Pētniecības grupa integrēja vairāku enzīmu izotermisko straujo nukleīnskābju amplifikācijas (MIRA) tehnoloģiju un reālā laika fluorescences noteikšanas metodes. Šī mikrofluidiskā mikroshēma nodrošina ātru, jutīgu un efektīvu risinājumu galveno garneļu patogēnu noteikšanai uz vietas.
Pētniecības fons un nozīme
Globālā garneļu audzēšanas nozare ir viena no vissvarīgākajām ekonomiskajām sastāvdaļām akvakultūrā, taču nozare jau sen saskaras ar dažādu patogēnu mikroorganismu draudiem. Šie patogēni bieži noved pie liela mēroga garneļu nāves, nopietni ietekmējot ražošanu un ekonomiskos ieguvumus. Ieskaitot akūtu hepatopancreatiskās nekrozes slimību (AHPND), baltā plankuma sindroma vīrusu (WSSV), infekcijas hipodermālu un hematopoētisko nekrozes vīrusu (IHHHNV), garneļu hemocītu iridovīrusu (šiv) un enterohepaticus (EHP) utt. Vīrieši, baktērijas un parasites pose.
Tradicionālās patogēna noteikšanas metodes, piemēram, polimerāzes ķēdes reakcijā (PCR tehnoloģijā), ir augsta jutība un specifiskums, taču tās ir sarežģītas, kas darbojas, prasa ilgu laiku un paļaujas uz laboratorijas aprīkojumu. Šie ierobežojumi padara PCR tehnoloģiju nepiemērotu ātrai pārbaudei uz vietas. MIRA tehnoloģija ir kļuvusi par molekulārās noteikšanas rīku, kas piemērots lietošanai uz vietas, jo tā straujās pastiprināšanas īpašības ir nemainīgā temperatūrā un normālā temperatūrā.
Mira tehnoloģijas princips
Multi-enzīmu konstantes temperatūras ātrās nukleīnskābju amplifikācijas tehnoloģija (MIRA tehnoloģija) ir nemainīgas temperatūras pastiprināšanas tehnoloģija, kas balstās uz vairāku funkcionālo olbaltumvielu sinerģiju istabas temperatūrā, lai panāktu ātru nukleīnskābju pastiprināšanu. Tā ir patiesi pārnēsājama ātras nukleīnskābju noteikšanas tehnoloģija uz vietas. Salīdzinot ar PCR, Mira ir vairāk priekšrocību.
Mikrofluidisko mikroshēmu projektēšana un jauninājumi
RPA noteikšanas platformas shematiska diagramma uz mikroshēmas vairākiem svarīgiem garneļu patogēniem mikroorganismiem
A) Diska tipa mikrofluidiskās mikroshēmas struktūra. 1: reakcijas kamera; 2: bumbiņas vārsts; 3: izplūdes osta; 4: paraugu ņemšanas ports;
B) eksplodēts skats. 5: siltuma blīvēšanas plēve; 6: mikroshēmas substrāts.
C) Sešu gruntējumu komplektu detalizēts izkārtojums nozarē. Katrs gruntēšanas komplekts ir iepriekš fiksēts noteiktā reakcijas kamerā.
D) Pilnīga darbības procedūra mikroshēmā RPA noteikšanas platforma.
Rakstā ir ierosināta mikrofluidiska mikroshēma, kas integrēta ar MIRA tehnoloģiju garneļu patogēno mikroorganismu daudzkārtējai noteikšanai. Mikrofluidiskā tehnoloģija var kontrolēt šķidrumus mikronu līmeņa kanālos precīzām manipulācijām, tādējādi sasniedzot efektīvu un lētu vairāku mērķu noteikšanu.
Čipam ir šādas atslēgas dizaina funkcijas:
● centrbēdzes mikrofluidiskā mikroshēma
Čipa izmanto centrbēdzes piedziņas dizainu, izmantojot centrbēdzes spēku, lai vienmērīgi sadalītu paraugu katrā reakcijas kamerā. Šis dizains vienkāršo darbības procesu, un operators var pabeigt visu reakciju, vienkārši ievadot paraugu.
● Vairāku mērķu noteikšana
Čipa ir iepriekš iestrādāta ar baktēriju veidiem, kas jāatklāj: akūta hepatopancreatiskā nekroze (V-AHPND), baltā plankuma sindroma vīruss (WSSV), infekcijas subkutāna nekrozes vīruss (IHHHHNV), garules hemocītu iridovīruss (shiv) un enterohepatititatata (ehe). ) Primer zondes pieciem patogēniem. Šis dizains vienlaikus var noteikt sešus gēnu mērķus vienā reakcijā, ļaujot ātri pārbaudīt vairākus patogēnus.
● Fluorescences noteikšana reāllaikā
Mira tehnoloģijas pastiprināšanas reakcija mikroshēmā tiek apvienota ar fluorescējošu zondi, kas reālā laikā var uzraudzīt pastiprināšanas reakcijas progresu. Zondes dizains ļauj fluorescējošo signālu atbrīvot tikai tad, kad tiek ģenerēts pastiprināšanas produkts, tādējādi sasniedzot ātru un jutīgu kvantitatīvu noteikšanu.
● Zema koncentrācijas reakcijas sistēma
Katrai mikroshēmas reakcijas vienībai ir nepieciešams tikai 5 μL reakcijas tilpums, kas ievērojami samazina reaģenta patēriņu. Kad darbojas visa sistēma, līdz četriem paraugiem var apstrādāt vienlaicīgi, un katrs paraugs var noteikt piecus patogēnus, ievērojami uzlabojot noteikšanas efektivitāti.
Jutība, specifiskums un atkārtojamība
CHIP sistēmas veiktspēja ietver simetrijas, rezonanses un atkārtojamības noteikšanu.
● Jutīgums
Eksperimentālie rezultāti rāda, ka mikroshēma var noteikt mērķa gēnu kopiju skaitu tik zemu kā 10 eksemplāri/μL, ar jutīgumu, kas ir salīdzināms vai pat augstāks nekā tradicionālās PCR metodes. Šī augstā jutība nodrošina, ka tehnoloģija var atklāt agrīni inficētus cilvēkus praktiskos lietojumos, tādējādi ļaujot agrīnai patogēnu skrīningam.
● specifiskums
Eksperimentā tika veikti savstarpējas reakcijas testi uz dažādiem nemainīgiem patogēniem, un rezultāti parādīja, ka mikroshēma ir ļoti specifiska mērķa patogēniem un var precīzi atšķirt dažāda veida patogēnus. Visi akūtas hepatopancreatiskās nekrozes slimības (V-AAHPND), baltā plankuma sindroma vīrusa (WSSV), infekcijas hipodermāla un hematopoētiskās nekrozes vīrusa (IHHHNV) testi, garu hemacyicic-zāģes vīruss (shiv) un enterohepatīts, kas ir šāda metode (EHP), kas izriet no visa starojuma, un enterohepatīts. nespecifiska pastiprināšana.
● Atkārtojamība
Lai novērtētu metodes stabilitāti, pētījumu grupa veica vairākus atkārtotus eksperimentus. Rezultāti parādīja, ka variācijas koeficients (CV vērtība) starp dažādiem eksperimentiem bija mazāks par 10%, parādot labu eksperimentālu atkārtojamību un konsekvenci.
Lauka lietojumprogrammas un priekšrocības
MIRA tehnoloģijas mikrofluidiskās mikroshēmas dizains dod tai ievērojamas lauka pielietojuma priekšrocības, īpaši piemērota patogēnu ātrai noteikšanai un uzraudzībai garneļu audzēšanā:
● Ērts darbības process
Visam noteikšanas procesam ir nepieciešams tikai ievadīt paraugu mikroshēmā un reakcijas ierīces palaišanai. Tas gandrīz neprasa manuālu darbību, un tas ir piemērots neprofesionāļiem, ko izmantot uz vietas.
● Ātra reakcijas spēja
Sistēma var iegūt testa rezultātus 20 minūšu laikā, ievērojami saīsinot testa laiku. Tas ir ļoti svarīgi, lai ātri reaģētu uz slimībām saimniecībās un samazinātu patogēnu izplatību.
● Multipleksa noteikšanas spēja
Vienā testā var identificēt piecus galvenos patogēnus, kas ievērojami uzlabo atklāšanas efektivitāti un ietaupa atklāšanas izmaksas un laiku.
Mira tehnoloģiju izredzes
Lai arī PCR tehnoloģija jau sen tiek vērtēta kā zelta standarts nukleīnskābju pastiprināšanas noteikšanai, MIRA tehnoloģija ir parādījusi lielu pielietojuma potenciālu, pateicoties tās straujajai reakcijai pastāvīgā temperatūrā, vienkāršā darbībā un zemu aprīkojuma prasībās. Salīdzinot ar PCR apvienojumā ar DNS sekvencēšanu, tika atklāts, ka izotermiskās pastiprināšanas mikroshēmas noteikšanas rezultāti atbilst PCR rezultātiem jutīguma un specifiskuma ziņā, un MIRA tehnoloģijas reakcijas laiks ir ievērojami saīsināts. Tāpēc MIRA tehnoloģijas mikrofluidiskās mikroshēmas tiek uzskatītas par tehnoloģiju, kas piemērota lauka lietojumiem, īpaši vidē, kurai nepieciešama ātra un liela mēroga patogēna noteikšana.
Mikrofluidiskās mikroshēmas, kas balstītas uz vairāku enzīmu izotermisko straujo nukleīnskābju amplifikācijas (MIRA) tehnoloģiju, nodrošina efektīvu instrumentu patogēno mikroorganismu noteikšanai garneļu audzēšanā. Šai tehnoloģijai ir augstas jutības, labas specifiskuma, vieglas darbības un ātras noteikšanas ātruma priekšrocības, un tai ir plašas piemērošanas iespējas akvakultūras slimību profilaksē un kontrolē. Paredzams, ka, turpinot attīstīt un optimizēt tehnoloģiju, sistēma tiks izmantota, lai noteiktu vairāk ūdens patogēnu, ļaujot plašākai slimību profilaksei un uzraudzībai.
Pētījuma rezultāti nodrošina uzticamu agrīnas noteikšanas metodi akvakultūras nozarei, kas var efektīvi samazināt slimību uzliesmojumu risku, uzlabot saimniecību ražošanas efektivitāti un izlaidi un izveidot tehnisku pamatu akvakultūras nozares ilgtspējīgai attīstībai.