《Jauna CAS13A/CAS12A mediēta attīstība"Viena katla" dubultā ģenētiski modificētu kultūru ekspresijas noteikšanas tests
Ģenētiski modificētas kultūras ir plaši stādītas visā pasaulē, un daudzas valstis ir pakāpeniski uzlabojušas savus regulatīvos pasākumus, lai nodrošinātu ģenētiski modificētu kultūru drošību. Ātras un precīzas ģenētiskās noteikšanas metožu attīstība ir ļoti svarīga lauksaimniecībai un bioloģiskai drošībai, un tā var mazināt sabiedrības bažas par ģenētiski modificētiem produktiem.
Šajā pētījumā pētījumu grupa izstrādāja jaunu viena katla reakcijas -- Mira divkāršu noteikšanu apvienojumā ar divkāršu CRISPR (MR-DCA metodi), lai vienlaicīgi noteiktu CAMV35S un NOS ģenētiskos mērķus ģenētiski modificētās kultūrās, nodrošinot vienkāršu un efektīvu noteikšanas metodi ģenētiski modificētu kultūru noteikšanai.
Eksperimentālās metodes
MIRA divkāršo produktu analizē ar CAS13A un CAS12A divkāršo sistēmu, lai ģenerētu divus neatkarīgus signālus, kas netraucē viens otram, un pēc tam dienasgaismas krāsu nolasa apgaismojuma instruments vai ar testa sloksni ar divām T līnijām, lai panāktu divkanālu rādījumu. Viss process tiek pabeigts mazāk nekā 35 minūtēs, ar noteikšanas robežu līdz 20 eksemplāriem.
(CAMV35S un NOS MR-DCA noteikšanas princips)
Viss eksperiments ir sadalīts trīs posmos: Mira pastiprināšanās, CRISPR reakcija un divas rezultātu interpretācijas metodes.
CAMV35S gēns tiek izmantots kā CAS13A mērķis, un NOS gēnu izmanto kā CAS12A mērķi. Tika veidoti attiecīgi divi Mira primeru pāri. CAS13A sistēma atpazīst tikai RNS, tāpēc priekšējais gruntēšanas reģions ir izstrādāts, kas satur T7 promotoru turpmākai CAS13A transkripcijai un aktivizēšanai. NOS gēnam tiek pievienots PAM. Iepriekš minētie papildinājumi nodrošina, ka gan CAS13A, gan CAS12A olbaltumvielas var saistīties ar attiecīgajām crRNS, un starp abām sistēmām nav traucējumu vai krusteniskās reakcijas.
Eksperimentālā situācija
Jutīgums un specifiskums
Paraugu atšķaidīja gradientā, lai pārbaudītu Mira reakcijas fluorescences intensitāti. Tika konstatēts, ka fluorescences intensitāti joprojām var noteikt parauga koncentrācijā 20 μL. Eksperimentam beidzot tika izvēlēta 20 μL koncentrācija.
(Krāsu attīstības un intensitātes kvantitatīvās aprēķināšanai tiek izmantotas dažādas paraugu koncentrācijas un testa strēmeles)
Lai vēl vairāk novērtētu MR-DCA specifiskumu, pētījumu grupa pārbaudīja jauktos dzīvnieku un transgēnisko augu paraugus. Rezultāti parādīja, ka tikai transgēniem paraugiem, kas satur CAMV35 un NOS, bija augsti fluorescences signāli, savukārt citu paraugu fluorescences intensitāte bija tuvu negatīvajai kontrolei. MR-DCA var izmantot kā īpašu divkāršu mērķa nukleīnskābju noteikšanas platformu.
24 ražas paraugus pārbaudīja MR-DCA. Starp tiem 1, 2, 15, 16, 21 un 22 ir transgēna kukurūza, kas satur CAMV35S promotoru. 7, 8, 23 un 24 ir slimības izturīgi transgēnie rīsi, kas satur NOS terminatoru. 3, 4, 11, 12, 13, 14, 17 un 18 ir transgēnas sojas pupas, kas satur CAMV35S promotoru un NOS terminatoru.
(24 paraugu testa rezultāti)
Ātra reakcija
Reakcijas laiks ir svarīgs faktors uz vietas noteikšanā. Pētniecības grupa novēroja, ka FAM un Hex fluorescences signālus var noteikt ar fluorescences instrumentu, kad reakcijas laiks bija 10 minūtes. Mira apvienojumā ar CRISPR reakciju novēroja arī dzelteno fluorescenci pēc 15 minūtēm.
(Fluorescences signāls dažādos mira reakcijas laikos)
(Testa sloksņu krāsu izstrāde dažādos Mira reakcijas laikos un intensitātes kvantitatīvās aprēķins)
Eksperimentāls secinājums
Eksperimentālie rezultāti parādīja, ka dubultā Mira ir laba specifiskums un tas var precīzi iegūt CAMV35 un NOS pastiprināšanas produktus. CAS13A un CAS12A sistēmas reaģē patstāvīgi, neiejaucoties viens otram. MR-DCA tests var precīzi noteikt 20 eksemplārus zemā temperatūrā 35 minūtēs, kurai ir liela vērtība, lai noteiktu ģenētiski modificētas kultūras laukā.
Informācija par rakstu
Žurnāla nosaukums: 《Journal of Advanced Research Express
Raksta nosaukums: 《Jauna CAS13A/CAS12A mediētā "viena katla" divkāršās noteikšanas tests ģenētiski modificētām kultūrām Express
Ietekmes koeficients: 11.4
Pētniecības grupa: Wang Xiaofu, Zhejiang Lauksaimniecības zinātņu akadēmija