Staphylococcus haemolyticus ir grampozitīva koagulāzes negatīva baktērija, kas ir ļoti izplatīta slimnīcās. Pēdējos gados arvien pieaug bažas, ņemot vērā augsto slimnīcu iegūto infekciju risku. Staphylococcus haemolyticus var vēl vairāk izraisīt ādas infekcijas, meningītu, peritonītu un pat sepsi. Klīniskās diagnozes kavēšanās var izraisīt veselības stāvokļa pasliktināšanos, tāpēc precīzas ārstēšanas atslēga ir stafilokoku haemolyticus ātra diagnoze.
Profesora Ji Tuo pētījumu grupa no Lianyungangas Centrālās laboratorijas katedras Otrās People slimnīcas katedras publicēja rakstu "Staphylococcus haemolyticus ātra un vizuāla noteikšana klīniskos paraugos ar mira-lfs" žurnālā "Analytica chimica Acta", ar ietekmes koeficientu 6,2.
Pētījuma pārskats
Šajā pētījumā prof. Ji Tuo grupa izveidoja metodi staphylolyticus haemolyticus noteikšanai ar MIRA-LFS, pamatojoties uz MVAA gēnu, un izmantoja vairāku enzīmu nemainīgas temperatūras ātras nukleīnskābes pastiprināšanas tehnoloģijas MIRA apvienojumā ar sānu plūsmas sloksni LFS, lai panāktu ātru patogēna noteikšanu. Eksperiments tika veikts 37 grādos, un rezultāti tika atklāti 9 minūšu laikā ar noteikšanas jutīgumu 0. 147 CFU/reakcija. MIRA-LFS noteikšanas metode ir piemērota Staphylococcus haemolyticus fiksēta punkta noteikšanai klīniskajos paraugos un realizē Staphylococcus haemolyticus identificēšanas metodi ar POCT, kas ir ļoti vērtīga, lai ātri diagnosticētu un ārstētu slimības nepietiekamās teritorijās. Pētniecības grupa izmantoja MIRA-LFS, QPCR un tradicionālās baktēriju kultūras metodes, lai analizētu 95 nejaušus klīniskos paraugus, un apstiprināja klīnisko pielietojamību.
Pētniecības metodes
Mira-LFS testa shematiska diagramma ir parādīta iepriekš. Šajā pētījumā tika izmantots AmpFuture Biotech DNS konstantes temperatūras ātras pastiprināšanas komplekts (koloidālā zelta testa sloksnes tips) un nukleīnskābes noteikšanas testa sloksne.
MVAA gēna gruntēšanas garums bija 30-35 nukleotīdi, un pastiprināšanas produkta garums bija 100-350 BP, un tika izstrādāti kopumā 6 pāri kandidātu praimeru. Standarta stafilolītisko stafilokoku celmu gDNS tika izmantota MIRA analīzei, tika pārbaudīti kandidātu praimeri un pastiprinātie produkti tika vizualizēti ar 2% agarozes gēla elektroforēzi.
(Pastiprināšanas produkti tiek parādīti, izmantojot agarozes gēla elektroforēzi)
Pēc tam zonde tiek izstrādāta atbilstoši priekšējās gruntēšanas secībai (16 bp atpakaļ). Zondes 5 'gals ir marķēts ar FITC un 3' gals ir marķēts ar C3. 31- pozīcijas nukleotīds zonde tiek aizstāts ar THF 30 bp attālumā no 5 'gala un 15 bp no 3' gala. Atlasītā reversā grunts 5 'gals ir marķēts ar biotīnu.
(Primer-zondes kombināciju dažādu dimēru shematiska diagramma un secības modifikācija)
Turklāt tika optimizēti reakcijas apstākļi MIRA-LF noteikšanai ar Staphylococcus haemolyticus. Pārbaudes tiek veiktas 37 grādos no 4-12 min ar 2 minūšu intervālu. Rezultāti ir parādīti 8 minūšu reakcijas laikā, un testa līnija ir skaidri redzama. Turklāt tests tiek veikts no 22-52 grāda ar 5 grādu intervālu. 37-42 grāds ir vispiemērotākā temperatūra Mira-LFS noteikšanai. Tāpēc Mira-LFS metodes optimālais reakcijas laiks un temperatūra Staphylococcus haemolyticus bija attiecīgi 8 minūtes un 37 grādi. Kopā ar faktu, ka gala rezultātu 1 minūtē vizualizē LFS, kopējais noteikšanas laiks ir 9 minūtes.
(Reakcijas laika un temperatūras optimizācija)
Eksperimentālie rezultāti
1. Jutīguma pārbaude
Mira-lfs tika pārbaudītas dažādas genoma DNS (GDNS) koncentrācijas, kas iegūtas no Staphylococcus haemolytica kultūru sērijveida atšķaidījumiem (1 0^6-10^0 cfu/ml).
(Pozitīvs signāls dažādās koncentrācijās)
Varbūtības vienības regresijas analīze parādīja, ka 95% LOD, ko noteica ar Mira-LFS testu, bija 0. 147cfu/reakcija.
(Noteikšanas aprēķina robeža)
2. specifiskuma validācija
Mira-LFS noteikšanas selektivitāte tika noteikta, analizējot 18 kopējo patogēno mikroorganismu celmus un 15 klīnisko stafilokoku haemolyticus celmus. Rezultāti parādīja, ka Mira-LFS tests bija negatīvs visām 18 citām patogēnām baktērijām, un pozitīva 15 pārbaudītiem Staphylococcus haemolyticus klīniskajiem paraugiem.
(Attiecīgi tika pārbaudīti 8 standarta patogēno baktēriju celmi un 15 klīniskā hemolītiskā streptokoku celmi)
Mira-LFS testam ir augsta selektivitāte, un tā ir piemērota Staphylococcus haemolyticus skrīningam.
3. Faktiskā parauga pārbaude
Kopumā no Lianyungang otrās Tautas slimnīcas nejauši tika savākti 95 paraugi, ieskaitot 35 ādas un mīksto audu paraugus, 16 urīna paraugus, 14 krēpu paraugus un 30 asiņu paraugus.
(95 klīniskie paraugi tika pārbaudīti ar dažādām metodēm)
Rezultāti parādīja, ka noteikšanas metode bija 100% saskaņā ar QPCR metodi. Turklāt, salīdzinot ar zelta standartu (GB/T4789. 11-2003), MIRA-LFS testa jutība un specifiskums Staphylococcus haemolytica infekcijas identificēšanai bija attiecīgi 100% un 98,73%. Šie rezultāti vēl vairāk apstiprina metodes tehnisko iespējamību Staphylococcus haemolyticus noteikšanā klīniskajos paraugos.
MIRA-LFS metodi izmanto stafilokoku haemolyticus straujai noteikšanai ar POCT, kas ir efektīva, precīza, vienkārša un rentabla, kas ir noderīga ātrai diagnozei un ārstēšanas lēmumiem.