Redzama un ātra kaķu chafamaparvovīrusa noteikšana, izmantojot daudzenzīmu izotermisku ātrās pastiprināšanas un sānu plūsmas mērstieņa testu
Žurnāls: Šūnu un infekciju mikrobioloģijas robežas
Ietekmes faktors:4.6
Kaķu chafamaparvovīruss(FeChPV)ir jauns parvovīruss, kas pirmo reizi tika atklāts caurejas kaķiem Kanādā 2019. gadā. Tā patogenitāte un molekulārās īpašības joprojām nav skaidras, un tam piemīt saimniekorganismu un ģenētiskā daudzveidība, tādēļ nepieciešama turpmāka epidemioloģiskā izmeklēšana. Pašlaik nav standartizētas metodes FeChPV noteikšanai.
Daudzu enzīmu izotermiskā ātrās pastiprināšanas{0}}sānu plūsmas mērstieņa (MIRA-LFD) metodeir veiksmīgi izmantots dažādu vīrusu noteikšanai, piedāvājot tādas priekšrocības kā ātrums, vienkāršība un nav nepieciešami precīzi instrumenti. Pētnieku grupa izveidoja MIRA-LFD metodi, kas piemērota FeChPV, lai risinātu problēmas vietējā klīniskajā noteikšanā. Nepaļaujoties uz precīziem instrumentiem,MIRA-LFD metode pabeidza FeChPV noteikšanu 37 grādos 20 minūšu laikā un neuzrādīja krustenisku-reaktivitāti ar citiem vīrusiem. Noteikšanas robeža bija 32,3 kopijas/μL,10 reizes augstāks nekā PCR metode. Turklāt MIRA-LFD metode atklāja 29 FeChPV-pozitīvus paraugus no 417 caurejas kaķiem, un pozitivitātes līmenis ir nedaudz augstāks nekā ligzdotās PCR metodes gadījumā. Šie rezultāti liecina, ka izveidotā MIRA-LFD metode FeChPV noteikšanai ir efektīva, ekonomiska, uzticama un vienkārša metode, kas veicina FeChPV infekcijas agrīnu profilaksi un kontroli.
1. Eksperimentālās metodes
Klīniskie paraugi:Šajā pētījumā izmantotie taisnās zarnas uztriepju paraugi tika savākti no 632 kaķiem (tostarp 417 ar caureju un 115 veseliem kaķiem) un 474 suņiem (tostarp 342 ar caureju un 132 veseliem suņiem) veterinārajās klīnikās Guandunas, Henaņas, Anhui, Džedzjanas2 un Džedzjanas reģionā2 un Innogolijas2 provincēs20. 2024. gads.
Nukleīnskābju pastiprināšana:Ekstrahētā DNS nukleīnskābe tika pievienota MIRA sistēmai. Rekombināze un praimeri veidoja kompleksu; ar palīgproteīnu un vienu-šķiedru saistošo proteīnu palīdzību tie iebruka divpavedienu DNS veidnē. Praimeri saistās ar homologiem komplementāriem reģioniem, veidojot D-cilpas reģionu, savukārt rekombināze tiek izjaukta no kompleksa. Polimerāze saistījās ar praimeru 3' galu un uzsāka DNS sintēzi, eksponenciāli pastiprinot mērķa reģionu veidnē. Šis process noritēja ātri un efektīvi, tādējādi panākot īpaši ātru mērķa fragmenta pastiprināšanu tikai 15 minūtēs.
Testa sloksnes krāsu izstrāde:Nukleīnskābes amplifikācijas produkts tika atšķaidīts 1:10, uzklāts uz testa strēmeles, un rezultāti tika nolasīti pēc 5 minūtēm.
Viss process no nukleīnskābes pastiprināšanas līdz teststrēmeles krāsas izstrādei aizņēma tikai 20 minūtes.
Eksperimentā tika izmantoti Amp{0}}nākotnes bioloģiskie produkti:
Pētījumā tika pārbaudīti četri izstrādāti specifisku primer{0}}zondes kombināciju komplekti. Rezultātu uzrādīšanai tika izmantota gan agarozes gēla elektroforēze, gan nukleīnskābju testa strēmeles. Visas četras primer-zondes kombinācijas varēja noteikt FeChPV vīrusu. Saskaņā ar agarozes gēla elektroforēzes rezultātiem FeChPV-4 kombinācija uzrādīja spilgtāko mērķa joslu, tāpēc šī kombinācija tika izvēlēta turpmākai pārbaudei.
Saskaņā ar agarozes gēla elektroforēzes rezultātiem, pastiprinot 5, 10, 15 un 20 minūtes, tika iegūta mērķa josla. Mērķa joslas intensitāte sasniedza maksimumu 15 minūšu amplifikācijas laikā, nosakot 15 minūtes kā optimālo reakcijas laiku šim testam. Pastiprināšana pie 36 grādiem, 37 grādiem, 38 grādiem, 39 grādiem un 40 grādiem radīja mērķa joslu, un spilgtākā josla tika novērota pie 39 grādiem, nosakot 39 grādus kā optimālo reakcijas temperatūru šim testam.
(Attēls A: 1: pastiprinājums 5 min; 2: pastiprinājums 10 min; 3: pastiprinājums 15 min; 4: pastiprinājums 20 min) (attēls B: 1: pastiprinājums 36 grādi; 2: pastiprinājums 37 grādi; 3: pastiprinājums 38 grādi; 4: amplifikācija 4: 0 grādi;
2. Detection Performance
Jutība:
(A attēls: MIRA rezultāti, kas parādīti, izmantojot agarozes gēla elektroforēzi)
(B attēls: ligzdotie PCR rezultāti, kas parādīti, izmantojot agarozes gēla elektroforēzi)
(C attēls: MIRA rezultāti, kas parādīti, izmantojot nukleīnskābju testa strēmeles)
Paraugi tika pakļauti 10 kārtīgiem sērijveida atšķaidījumiem, sākot no 3,23 × 10⁶ kopijas/μL. Nested PCR ar agarozes gēla elektroforēzi varēja stabili noteikt 3,23 × 10² kopijas/μL; MIRA ar agarozes gēla elektroforēzi un MIRA ar nukleīnskābju testa strēmelēm varēja stabili noteikt 3,23 × 10¹ kopijas/μl.
MIRA metode uzrādīja konsekventu jutību, izmantojot divus dažādus rezultātu prezentācijas formātus, un MIRA metodes jutība bija pārāka par ligzdotās PCR.
Specifiskums:
(1: FeChPV, kaķu chafamaparvovīruss; 2: FPV, kaķu panleikopēnijas vīruss; 3: FeAstV, kaķu astrovīruss; 4: FBoV, kaķu bokavīruss; 5: CachaV, suņu chaparvovīruss; 6: negatīva kontrole)
Jaunizveidotā MIRA-LFD metode atklāja tikai FeChPV un neuzrādīja krustenisku-reaktivitāti ar citiem atsauces vīrusiem, kas liecina par labu specifiskumu.
3. Pētījuma kopsavilkums
Šajā pētījumā tika izveidota MIRA-LFD metode FeChPV noteikšanai, neizmantojot augstas-precizitātes instrumentus. Kā efektīva, ekonomiska un uzticama noteikšanas metode ar augstu jutību un specifiskumu, MIRA-LFD metode ir vairāk piemērota klīniskai noteikšanai, nodrošinot tehnisko atbalstu FeChPV infekcijas agrīnai profilaksei un kontrolei.
4.AMP-NĀKOTNES BIOTEHNIKA
MIRA daudzenzīmu izotermiskā ātrā nukleīnskābju pastiprināšana ir tehnoloģija, kas patiešām nodrošina ātru noteikšanu uz vietas.
MIRA tehnoloģija balstās uz in vivo gēnu rekombinācijas labošanas mehānismu, balstoties uz vairāku funkcionālu proteīnu sinerģisku darbību istabas temperatūrā, lai panāktu ātru (5-20 min), jutīgu, specifisku un drošu nukleīnskābju amplifikāciju istabas temperatūrā (25 grādi – 45 grādi). Pateicoties MIRA tehnoloģijas izotermiskajam raksturam, tai ir zemas aprīkojuma prasības un vienkārša darbība. Izmantojot miniaturizētas pārnēsājamas ierīces, to var izmantot priekšējās līnijas testēšanai dažādos pielietojuma scenārijos, nodrošinot ātru un precīzu nukleīnskābju testēšanu tādos iestatījumos kā POCT, testēšana mājās, lauksaimniecības laukos un tiesībaizsardzība uz vietas. Pamatojoties uz MIRA tehnoloģiju, uzņēmums Amp-future Biotech ir izstrādājis virkni ātrās testēšanas produktu uz-uz vietas, tostarp ātrās nukleīnskābju atbrīvošanas līdzekļus, izotermiskus ātrās nukleīnskābju pastiprināšanas reaģentus, koloidālās zelta testa strēmeles un miniaturizētas pārnēsājamas iekārtas, radot vispārēju risinājumu{11}ātrās molu testēšanas vietā. Turklāt Amp-future MIRA tehnoloģija piedāvā lietojuma priekšrocības, ja to apvieno ar CRISPR tehnoloģiju, NGS, SNP, mikrofluidiku un daudz ko citu.
Papildus iepriekš norādītajiem ātrās{0}uz vietas testēšanas produktiem, Amp-future Biotech piedāvā arī:
Pētījuma reaģenti:Reaģentu izejvielu un tehniskā atbalsta nodrošināšana fundamentālajiem zinātniskajiem pētījumiem, kā arī projektu literatūras atsauces.
OEM ražošana:Spēj neatkarīgi ražot augstas -tīrības, augstas{1}}aktivitātes gatavos produktus visā procesā, panākot rūpniecisku-ražošanu.
Projekta izstrāde pēc pasūtījuma:Sekvences informācija un secību saskaņošanas analīzes rezultāti, projekta primer{0}}zondes projektēšana un sintēze, projekta plazmīdu sintēze un paraugi, projekta ziņojumi un rezultāti utt.
Lai iegūtu vairāk informācijas, laipni lūdzam interesēties.