Molekulārās diagnostikas tehnoloģijas mūsdienās attīstās bezprecedenta tempā ar ievērojamiem sasniegumiem pēdējo divu gadu laikā. Starp tām izotermiskās pastiprināšanas tehnoloģijas ir ieguvušas lielāku uzmanību, pateicoties to spējai veikt pastiprināšanu bez nepieciešamības pēc specializēta aprīkojuma. Pastāv vairākas labi zināmas izotermiskas pastiprināšanas metodes, piemēram, LAMP, RPA un RAA. Tomēr šodien es vēlos ieviest jaunāku izotermisko amplifikācijas tehnoloģiju-miRA.
Lai nodrošinātu, ka ikvienam ir konsekventa izpratne par galvenajiem jēdzieniem, šeit ir daži terminu skaidrojumi:
- Rekombināzes polimerāzes amplifikācija (RPA): šī ir rekombināzes starpniecību pastiprinātās tehnoloģija.
-Rekombināzes pastiprinātā amplifikācija (RAA): līdzīga rekombināzes mediētā amplifikācijas metode.
- cilpas mediētā izotermiskā pastiprināšana (LAMP): vēl viena izotermiska pastiprināšanas tehnika.
- Multienzīmu izotermiska ātra pastiprināšanās (MIRA): jauna izotermiska ātras pastiprināšanas tehnoloģija.
Ātrs kopsavilkums un skaidrojums:
Daudziem varētu rasties jautājums, kura no šīm dažādajām izotermiskajām pastiprināšanas metodēm ir uzticamāka un stabilāka. Patiesībā katrai tehnoloģijai ir savas stiprās puses un ierobežojumi. Tomēr galvenie veiksmīgas pieņemšanas faktori ir spēja samazināt ražošanu ticami, zemas izmaksas un stabilu veiktspēju dažādās lietojumprogrammās.
Tagad es īsi analizēšu katru tehnoloģiju, pamatojoties uz to, ko es zinu:
Lampa (cilpas mediēta izotermiskā pastiprināšana):
Daudzi laukā zina, ka lukturis ir radies Japānā, kuru Dr. Notomi 2000. gadā izstrādāja kā jaunu gēnu pastiprināšanas paņēmienu. Pašlaik šī tehnoloģija pieder Japānas uzņēmumam Eiken Chemical Co., Ltd.
Priekšrocības:
- augsta jutība (2-5 lieluma pakāpes augstākas nekā tradicionālās PCR metodes).
- Īss reakcijas laiks (reakcijas var pabeigt 30-60 minūtēs).
- Komplekta izstrādes laikā nav ieteicams veikt īpašus instrumentus klīniskajā lietošanā (lai gan komplekta izstrādes laikā ieteicams reāllaika turbidimetrs).
- Viegli darbināma (neatkarīgi no tā, vai tiek noteiktas DNS vai RNS, process ietver reakcijas šķīduma, fermentu un veidnes sajaukšanu reakcijas mēģenē, pēc tam inkubē apmēram 63 grādos 30-60 minūtes ūdens vannā vai inkubatorā, ar rezultātiem, kurus neapbta acs novēroja).
Trūkumi:
- Augsta jutība var izraisīt aerosola piesārņojumu, tiklīdz caurule ir atvērta, padarot to nepiemērotu lietošanai ārpus PCR laboratorijas, jo ir augsts viltus pozitīvu rezultātu risks.
- Primer dizains ir izaicinošs, padarot to nepiemērotu dažām slimībām, īpaši tām, ko izraisa vīrusi ar dažām kopīgām secībām.
- tā piemērošana ir salīdzinoši ierobežota.
RPA un RAA izotermiskās pastiprināšanas tehnoloģijas:
Šīs divas metodes lielākoties ir homoloģiskas, un galvenā atšķirība ir izmantotās rekombināzes avots.
- RPA rekombināze nāk no T4 bakteriofāga.
- RAA rekombināze ir iegūta no baktērijām vai sēnītēm.
Galvenie darba principa punkti:
1. ATP klātbūtnē rekombināze saistās ar grunti, veidojot olbaltumvielu-nukleīnskābes kompleksu, kas pēc tam meklē atbilstošu mērķa DNS.
2. Kad gruntējums atrod atbilstošo DNS veidni, ATP hidrolīze nodrošina enerģiju rekombināzei, lai pamestu grunti, un DNS polimerāze sintezē jaunu DNS virkni.
3. Tajā pašā laikā vienpavedienu DNS saistošie proteīni (SSB) saistās ar pārvietoto DNS virkni, lai novērstu dubultās virknes reformāciju.
Priekšrocības:
- RPA/RAA reakcija ir ļoti ātra, un rezultāti ir sasniedzami apmēram 30 minūtēs.
- Jutīgums var sasniegt 10 eksemplārus/μl.
- Amplifikācijas laikā nav nepieciešams sarežģītas iekārtas.
-Turpmāka zondei balstītu vai koloidālo zelta hromatogrāfijas metožu attīstība ievērojami vienkāršo rezultātu interpretāciju, padarot tās labi piemērotas izmantošanai ierobežotās vai ekonomiski nelabvēlīgos apgabalos.
Trūkumi:
- RPA ir tehnoloģija, ko izstrādājusi Lielbritānijas uzņēmums Twistdx, kas tagad pieder Abbott, kā rezultātā rodas augstas izmaksas, gari piegādes cikli un tehniskā atbalsta trūkums. Tas Ķīnā apgrūtina liela mēroga lietojumprogrammu un masveida ražošanu.
- RAA ir tīri sadzīves tehnoloģija, taču tai trūkst stabilitātes traucējumu rezistences un produktu reaģenta konsekvences ziņā. Turklāt ir jāuzlabo funkcionālo enzīmu ražošanas process. Lai arī tehnoloģija tirgū ir bijusi piecus gadus, tā vēl nav plaši izmantota stabilitātes un daudzpusības problēmu dēļ.
- Gan RPA, gan RAA ir nepieciešami grunti, kas ir 30-35 bp garums. Īsāki grunti ietekmē specifiskumu, jutīgumu un pastiprināšanas ātrumu, padarot gruntēšanas dizainu izaicinošu.
Mira (multienzīmu izotermiska ātra pastiprināšana):
Mira ir jauna izotermiska pastiprināšanas tehnoloģija, kas ieviesta vidū -2019. Tas ir homologs RPA un RAA.
Lai arī Mira dalās ar RPA un RAA darba principu ziņā, fermentu atlasē, kultivēšanā, attīrīšanā un citos liela mēroga ražošanas aspektos ir būtiskas atšķirības. Turklāt tehniskā komanda, kas atrodas aiz Mira izstrādātāja AmpFuture, ir pavadījusi gandrīz 11 gadus, lai pilnveidotu tehnoloģiju. Tagad tas ir pilnībā aprīkots, lai atbalstītu gatavu reaģentu, pielāgotu attīstības, pētniecības projektu un citu pielāgojamu pakalpojumu attīstību.
Priekšrocības:
1. Mira reaģentu funkcionālie proteīni tiek iegūti no dažādiem fermentiem, dažiem fermentiem tiek veiktas mērķtiecīgas modifikācijas, lai uzlabotu kodola enzīmu sistēmas efektivitāti, kā rezultātā izveidojas visaptverošāka sistēma.
2. Spēcīga pretestība traucējumiem un stabilitāte. Mira reaģentiem tiek veikta plaša optimizācija kofaktora izvēles un koncentrācijas ziņā, kā arī sasaldēšanas žāvēšanas procesi, padarot tos izturīgākus pret traucējumiem un stabilākiem.
3. Pielāgošana un daudzpusība. Sakarā ar pilnīgu kontroli pār funkcionālo olbaltumvielu ražošanu un dziļu tehnoloģijas izpratni, MIRA var pielāgot dažādām lietojumprogrammām, piedāvājot dažādas reaģentu sistēmas un personalizētus pielāgošanas pakalpojumus.
4. Patentētie patenti. Tā kā MIRA ir 100% attīstīta vietējā tirgū, produktu attīstības laikā nav riska patentu pārkāpumu. Tas Mirai dod konkurences priekšrocības gan vietējos, gan starptautiskos tirgos.
5. Ir izveidots pilnīgs ražošanas protokols, kas ļauj veikt stabilu liela mēroga ražošanu.
Trūkumi:
1. Tirgus atpazīšana joprojām ir zema, un, lai iegūtu plašāku pieņemšanu, ir nepieciešami vairāk datu un atsauces no dažādām jomām (piemēram, pozitīvas likmes dažādās jomās).
2. gruntēšanas dizains joprojām seko RPA vai RAA īpašībām, kurām ir vajadzīgas garākas gruntēšanas vai zondes sekvences, kas, iespējams, neveicina ātru slēdzi pašreizējiem PCR lietotājiem.